研究背景
免疫检查点阻断（ICB）疗法，尤其是针对PD-1/PD-L1的抗体，在肿瘤治疗中取得了显著进展。然而，由于其局限性，如抗体内吞降解、PD-L1再填充和上调等耐药机制，限制了其疗效。因此，降低肿瘤细胞中PD-L1水平成为一种新的治疗策略，以克服传统免疫检查点阻断的耐药性。
2024年8月13日，西安交通大学第一附属医院何旺骁研究员何旺骁及闫瑾研究员共同通讯在Nature Communications在线发表了题为“Reinvigoration of cytotoxic T lymphocytes in microsatellite instability-high colon adenocarcinoma through lysosomal degradation of PD-L1”的论文，该研究开发了一种名为IgP β的新型人工蛋白，能够响应肿瘤酸性微环境，并通过HSC70介导的溶酶体降解途径特异性地降解PD-L1；此外，IgP β能够有效降低肿瘤细胞、细胞膜和外泌体中PD-L1的水平，并激活T细胞，抑制肿瘤生长，为开发新型抗肿瘤药物提供了新的思路。
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研究结果
COAD联合MSI-H最有希望减轻PD-L1的治疗负担
通过生物信息学分析，评估了30种常见肿瘤中免疫抑制因子的表达与肿瘤PD-L1表达的关系以及78例MSI-H COAD临床样本中肿瘤浸润免疫细胞的丰度，结果显示PD-L1 表达与所有 20 种免疫抑制因子均呈显著正相关，并且MSI-H COAD中PD-L1的表达水平显著高于MSI-L和MSS COAD，此外，PD-L1 表达与 T 淋巴细胞和 CTL 的浸润水平呈显著正相关，说明PD-L1在MSI-H COAD中高表达，并与免疫抑制和T细胞浸润密切相关，提示PD-L1可能是MSI-H COAD免疫治疗的重要靶点。
D-H共同提示MSI-H COAD中免疫逃避的潜在主要机制是抑制CT功能，而CTL功能受到PD-L1高负荷的阻碍。为了进一步验证这一假设，将 PD-L1 过表达和正常表达的 MC38 细胞系分别移植到小鼠皮下，构建 MSI-H 结肠腺癌模型，利用单细胞转录组测序、流式细胞术和GSEA分析，结果表明PD-L1通过抑制CTL功能，导致Treg细胞增多和CTL细胞中GzmB和IFγ表达降低，从而抑制抗肿瘤免疫反应；同时，PD-L1促进肿瘤细胞增殖，并通过上调T细胞共抑制途径相关基因集，增强肿瘤免疫抑制，共同导致肿瘤免疫逃逸和恶性进展。
MPHP通过诱导hsc70依赖性溶酶体降解减轻PD-L1的负担
为了解决肿瘤细胞对 PD-1/PD-L1 免疫检查点阻断疗法的耐药性设计了MPHP，通过分子对接分析发现MPHP与PD-L1和HSC70具有较强的结合能力，此外，免疫荧光共定位实验结果显示在用Arg6-MPHP处理HCT116细胞后，红色荧光标记的PD-L1和绿色荧光标记的HSC70出现明显的共定位现象，而用 Arg6-MPHPCtrl处理的细胞则没有明显的共定位。此外，PD-L1和LAMP2也出现明显的共定位现象，则表明Arg6-MPHP可以特异性结合PD-L1和 HSC70，通过HSC70介导的溶酶体降解途径降低PD-L1表达水平，从而抑制肿瘤细胞的免疫逃逸。
TAME响应型人工蛋白IgP β的构建
为了确定MPHP与MSI-H靶向递送至COAD的有效策略，建立PD-L1过表达型MSI-H结肠腺癌小鼠模型，进行蛋白组学分析，结果显示与正常结肠组织相比，MSI-H结肠腺癌肿瘤组织中上调表达的蛋白质主要与无氧代谢相关，下调表达的蛋白质主要与有氧代谢相关，表明 MSI-H 结肠腺癌肿瘤组织存在明显的酸性肿瘤微环境 (TAME)；随后进行了代谢组学分析，结果显示与正常结肠组织相比，MSI-H 结肠腺癌肿瘤组织中下调表达的代谢物主要与无氧代谢相关，上调表达的代谢物中超过一半与无氧代谢相关，进一步证实了MSI-H结肠腺癌肿瘤组织存在明显的TAME。
为优化 MPHP 的药物特性，使其更适合作为治疗MSI-H结肠腺癌的药物，设计了IgP α和IgP β，分别由MPHP和pH-MPHP通过金硫醇相互作用进行自组装，通过扫描电镜、动态光散射、流式细胞术等实验进行分析，研究结果显示IgP β表现出良好的TAME响应性，在肿瘤靶向性、细胞摄取能力、胶体稳定性、药物释放和安全性等方面优于IgP α。
IgP β具有良好的生物安全性
通过血液学、血清生化、组织病理学和急性毒性实验评估IgP β对小鼠的毒性，结果显示IgP β对小鼠的血液学指标、血清生化指标、组织病理学分析以及体重均没有显著影响，没有引起小鼠的溶血、骨髓抑制、贫血、白细胞减少和血小板减少等不良反应，也没有引起小鼠的免疫毒性、肝毒性、肾毒性、肺毒性、脾脏和心脏毒性，说明IgP β具有良好的生物安全性。
IgP β有效诱导PD-L1溶酶体降解
为研究IgP β的有效性，进行免疫荧光和 Western Blot 实验，结果发现IgP β在体内外均能有效降低 PD-L1 的表达水平，IgP α和IgP β 均呈剂量依赖性降解 PD-L1，但IgP β的降解效果更强；此外，体内实验免疫组化结果显示，IgP β 能有效降低肿瘤组织中 PD-L1 的表达水平，还能上调肿瘤组织中免疫活性因子，并抑制肿瘤生长，说明IgP β能够有效诱导 PD-L1的溶酶体降解，并具有靶向性和体内抗肿瘤活性。
IgP β通过PD-L1降解在体内恢复CTL的作用
为了研究基于IgP β的免疫治疗的潜在机制，对皮下MC38肿瘤过表达PD-L1的小鼠进行了单细胞RNA测序，结果显示IgP β治疗后肿瘤细胞比例显著降低， Ki67/PCNA 阳性细胞比例显著降低，说明肿瘤细胞减少，细胞增殖受到抑制，细胞凋亡增加；此外，CD8 阳性 T 淋巴细胞 (CD8+ T) 比例增加，CD25/FOXP3 阳性调节性 T 细胞 (Treg) 比例降低，说明 Treg 细胞被抑制，CD8+ T 细胞被激活，GSEA 分析显示，CD8 TCR 相关基因集、T 细胞激活相关基因集、CD8+ T 细胞激活相关基因集显著上调，caspase 激活相关基因集显著下调，进一步证实了CTL功能的恢复。
IgP β能有效抑制人源化PDX和PDOX COAD小鼠模型的肿瘤进展
为进一步验证人源化患者源异种移植物作为临床转化模型的可行性，将患者肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠体内，并注入患者免疫细胞，建立模拟人体肿瘤微环境的人源化PDX和PDOX COAD小鼠模型，利用IHC染色和免疫荧光染色等实验研究IgP β在人源化PDX小鼠模型中对MSI-H结肠癌的抑制情况，结果显示 IgP β可以有效降低MSI-H结肠癌中PD-L1的表达，并通过增强免疫激活和促进细胞凋亡来抑制肿瘤进展，展现出优于抗PD-1治疗的疗效。
为了进一步评估IgP β的疗效，将手术切除肿瘤的癌细胞植入NSG小鼠结肠肠系膜下组织，建立COAD患者源性原位异种移植(PDOX)模型，结果显示IgP β通过降低PD-L1表达、增强免疫细胞浸润和免疫激活以及促进细胞凋亡来抑制 MSI-H 结肠癌的进展，展现出优于抗 PD-1 治疗的疗效，并且具有良好的安全性。
结论
本研究为治疗MSI-H结肠腺癌，设计了TAME响应型人工蛋白IgP β，结果表明 IgP β通过促进PD-L1的溶酶体降解来降低MSI-H结肠癌中 PD-L1 的表达，并有效抑制肿瘤进展，展现出优于抗PD-1治疗的疗效，其优势在于靶向性强、作用机制独特且安全性良好，有望作为 MSI-H 结肠癌的辅助治疗或应用于其他表达PD-L1的肿瘤治疗，为未来肿瘤免疫治疗提供新的思路和重要药物。
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