项目文章丨芫花酯甲通过泛素化降解 ASCT2，抑制头颈鳞状细胞癌生长

头颈鳞状细胞癌（HNSCC）进展快、转移率高且治疗耐药性显著，超过65%的患者确诊时已处于晚期，五年生存率低于4%，亟需新的治疗策略。代谢重编程是癌症的重要特征，HNSCC高度依赖谷氨酰胺代谢，其作为条件必需氨基酸，通过SLC转运体进入细胞，支持肿瘤生长。其中，丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运体2（ASCT2）作为关键谷氨酰胺转运体，在HNSCC中过表达且与不良预后相关，但其靶向治疗面临药物缺乏和特异性不足等挑战，因此，开发安全有效的ASCT2靶向药物对HNSCC治疗具有重要意义。

2025年5月15日，Acta Pharmacologica Sinica在线发表了题为“Yuanhuacine suppresses head and neck cancer growth by promoting ASCT2 degradation and inhibiting glutamine uptake”的论文，文章通过多组学和体内外实验，系统阐明了 芫花酯甲（YC）通过降解 ASCT2、阻断谷氨酰胺代谢和损伤线粒体功能抑制 HNSCC 的机制，为头颈癌的精准代谢治疗提供了新的候选化合物和理论依据。

为了评估ASCT2在HNSCC中的临床意义，研究首先使用癌症基因组图谱（TCGA）数据库进行了生物信息学分析。与正常组织相比，ASCT2在HNSCC肿瘤样本中的表达显著升高；临床HNSCC患者活检标本的组织芯片染色进一步证实了这一发现，肿瘤组织中ASCT2蛋白水平高于邻近非肿瘤组织；表明ASCT2表达升高与疾病进展相关。

单细胞RNA测序分析显示，与其他细胞类型相比，ASCT2主要在恶性上皮细胞中表达。为了探索ASCT2在HNSCC中的功能作用，利用DepMap数据集的siRNA和CRISPR数据，发现ASCT2敲低抑制多种HNSCC细胞系的生长，包括CAL33和CAL27细胞，强调了ASCT2在肿瘤细胞增殖中的重要作用。此外，在临床HNSCC样本中，ASCT2表达与细胞增殖标志物Ki-67呈正相关。为了验证这一点，使用慢病毒shRNA生成了稳定的asct2敲低HN6细胞，并用siRNA-2113和shASCT2验证了敲低效率，谷氨酰胺剥夺显著降低了HN6和CAL33细胞的克隆形成，ASCT2敲低显著损害了HN6细胞的克隆生长，而ASCT2的重新表达恢复了这一作用，证实了其在支持谷氨酰胺依赖性增殖中的作用。此外，将ASCT2敲低与谷氨酰胺剥夺相结合，对细胞增殖的抑制作用增强，强调了ASCT2表达与谷氨酰胺可用性之间的相互作用。

采用虚拟筛选和细胞毒性试验来鉴定特异性靶向ASCT2的候选化合物，结果显示在这些化合物中，YC表现出最有效的抗肿瘤作用，对HN6、CAL33和SCC7细胞的半最大抑制浓度（IC50）分别为1.43µM、6.62µM和6.46µM。为了进一步评估YC的影响，利用实时细胞分析监测处理30h后HN6细胞的生长曲线，结果表明YC抑制细胞增殖呈时间和剂量依赖性。使用Nanolive Label-Free 3D成像技术，观察到YC处理后细胞快速萎缩、染色质浓缩和质膜破裂等形态学特征与凋亡一致。CETSA结果表明，YC在43°C和52°C时稳定ASCT2，DARTS实验表明，在蛋白水解过程中，YC稳定了ASCT2，表明YC与ASCT2直接结合。微尺度热泳实验进一步支持了这一发现，表明YC直接与ASCT2结合。

分子对接分析预测YC与ASCT2在脯氨酸（Pro） 432和甘氨酸（Gly） 228位点通过两个氢键结合，与苏氨酸（Thr） 350和赖氨酸（Lys） 288位点结合。MST之后的定点突变证实Gly228和Pro432是结合的关键残基，因为这些位点的突变显著损害了YC的亲和力。此外，对YC/ASCT2复合物进行了600 ns的分子动力学模拟，显示出稳定的构象；功能上，ASCT2敲低显著减轻了YC在HN6细胞中的抑制作用。综上证明ASCT2是YC的直接靶点。

YC 处理 HN6 细胞后，ASCT2 蛋白水平呈剂量和时间依赖性降低，该降解过程可被蛋白酶体抑制剂 MG132 逆转，说明 ASCT2 通过泛素 - 蛋白酶体途径降解；Co-IP 实验显示 YC 促进 ASCT2 的泛素化修饰；通过 Co-IP 结合 LC-MS/MS 分析，发现 RNF5 是与 ASCT2 相互作用的关键 E3 泛素连接酶，进一步实验证实 YC 增强 ASCT2 与 RNF5 的结合，而敲低 RNF5 显著抑制 YC 诱导的 ASCT2 降解及泛素化水平；SPPIER 实验可视化显示 YC 促进 ASCT2-YC-RNF5 三元复合物的形成，综上表明 YC 通过招募 RNF5 介导 ASCT2 的泛素化降解，进而发挥抗肿瘤作用。

转录组测序显示，YC（5 μM）处理 HN6 细胞 24 小时后，3148 个基因显著下调，KEGG 富集分析表明这些基因主要富集于 “TCA 循环”“谷氨酰胺代谢” 等代谢通路。蛋白质组和代谢组分析进一步验证，YC 处理导致 TCA 循环关键酶（如 SDHB、MDH1）表达下调，谷氨酰胺、谷氨酸及 TCA 中间产物（琥珀酸、α- 酮戊二酸）水平显著降低，表明谷氨酰胺代谢通路被系统性抑制。13C同位素示踪实验显示，YC 抑制 [U-13C5] 谷氨酰胺向 TCA 循环的碳流入，谷氨酸和琥珀酸的13C 标记率显著下降，证实 YC 阻断谷氨酰胺的代谢利用。实时定量 PCR 验证，YC 下调 TCA 循环关键基因（SUCLA2、SDHB、IDH1 等）的 mRNA 表达，与转录组和代谢组结果一致，表明转录水平调控参与代谢抑制。

透射电镜观察到 YC（5 μM）处理 24 小时后，HN6 细胞线粒体出现嵴肿胀、基质空间扩大及 cristae 破坏等结构异常；氧消耗率（OCR）检测显示，YC 显著抑制线粒体基础呼吸和最大呼吸速率，并降低 ATP 生成量；JC-1 染色表明 YC 导致线粒体膜电位（MMP）崩溃，NAD+/NADH 比值升高；而敲低 ASCT2 可显著逆转 YC 对线粒体功能的抑制作用，证实 YC 通过降解 ASCT2 引发线粒体功能障碍，影响细胞能量代谢，进而抑制肿瘤细胞生长。

本研究系统揭示了ASCT2在头颈部鳞状细胞癌中促进肿瘤发生和进展的关键作用，并鉴定出天然小分子化合物芫花酯甲作为靶向ASCT2的有效抑制剂。YC是一种高效的 ASCT2 靶向降解剂，通过与 ASCT2 的 Gly228 和 Pro432 位点结合，招募 E3 泛素连接酶 RNF5，促进 ASCT2 的泛素化及蛋白酶体依赖性降解，从而抑制谷氨酰胺摄取，阻断其向 TCA 循环的碳流入，引发线粒体功能障碍，导致 ATP 生成减少和 NAD+/NADH 比值升高，最终在体内外显著抑制头颈鳞癌（HNSCC）细胞的生长、增殖并诱导凋亡，且在异种移植和原位肿瘤模型中证实其抑瘤效果依赖于 ASCT2，为 HNSCC 的代谢靶向治疗提供了新的候选化合物和作用机制。