活体代谢流

一、细胞处理

1 、设置实验组和对照组，每组至少6 个重复+1 个非标记对照。

2 、培养皿用 15 mL  普通培养基铺板 70% -90% confluence（细胞生长汇合度）。 注意：每次吸取细胞的培养液都要混匀。

3、培养皿置于培养箱中，手指放置孔板面上，快速横向摇动 3  下，纵向摇动 3 下，之后不再移动孔板。目的是让细胞均匀生长。注意：摇匀后不再动孔板，孔 板不要叠着放。

二、更换培养基

1、在细胞处于对数生长期时（贴壁细胞约 5×10⁶ ~ 2×10⁷ 个；悬浮细胞约1×10⁵ ~ 1×10⁶ 个 /mL）更换同位素标记的培养基，从培养箱中取出所有培养皿，真空抽吸器吸弃培养液（注意：此处勿用移液 管移液，以防不能彻底去除原有培养液），分别用 7 mL 37℃的 PBS  润洗三次细胞后（注意：洗液体积要大于培基体积以便清洗培养皿的内壁）。

2、每个培养皿 加 8mL  配好的同位素培养基。注意：在培养皿上记录确切换液时间，此步操作 速度尽量快，培养标记时间根据研究的代谢途径确定。

注意：

1. 需保证最后过滤好的培养基是无菌的，以防止培养细胞污染；

2. 一般在life/Invitrogen/Gibco 可以买到无Glucose的DMEM培养基，也可以用无Glutamine 的DMEM或者1640培养基来做标记Glucose或标记Glutamine的实验。

3. 同位素标记培养基中Glucose浓度应与原培养基中Glucose浓度一致。例如，哺乳动物细胞培养基的浓度约1 g/L。

三、标记时间

标记时长是指换上标记培养基后的时间，去除普通培养基后换上标记培养基开始记录，为标记 0h 样本，如果需要收集标记 12h 的样品，就是指换上标记培养基后的第 12h 收集样品，以此类推，如果需要收集标记 24h 的样品，就是指换上标记培养基后的第 24h 收集样品。

（通常情况下，需要查阅相关研究文献，参考文献研究设计，结合自身研究情况

和实验目的设计培养时间点。）

四、细胞收集（建议细胞数≥10^7 ，肿瘤细胞≥2×10^6）

收集细胞前，在显微镜下观察细胞是否有污染，如果细胞正常，对细胞进行计数。

3.1 贴壁细胞：

1）从培养箱中取出所有培养皿，真空抽吸器吸弃培养液。

2）缓慢倒约 10 mL 37℃生理盐水至每个培养皿，盖上盖子，画圈摇晃 2-3  下， 用抽吸器抽吸生理盐水；再用 10mL生理盐水重复上述步骤复洗一次，用抽吸器完全抽吸掉生理盐水。

3）各皿细胞加入 1mL 的80%甲醇溶液（-20 度预冷），细胞刮刀刮取全部细胞，转移到干净 safe-lock 离心管，用封口膜封严，-80 度冰箱保存，干冰运输。

3.2 悬浮细胞：

1）从培养箱中取出所有培养皿，200g 离心收集细胞，弃去上清；

2）37°C 预热无菌生理盐水（1mL）重悬细胞，200g 离心；

3）再次37°C无菌生理盐水重悬细胞，混匀后转移至1.5mL safe-lock 离心管，200g 离心，弃去上清；

4）各管加入 500 微升的 80%甲醇溶液（-20 度预冷），用封口膜封严,-80 度冰箱保存，干冰运输。