表观遗传丨一文带您看懂ATAC-seq、ChIP-seq、CUT&Tag、RIP-seq、CLIP-seq的区别！

表观遗传学是研究在DNA序列不发生改变的情况下，基因表达发生可遗传变化的科学。这一领域涵盖了多种技术手段，用于探索DNA甲基化、染色质结构、蛋白质-DNA相互作用、蛋白质-RNA相互作用以及基因表达的调控机制。

在研究某个转录因子的调控机制时，可以通过ATAC-seq来识别该转录因子可能结合的开放染色质区域，然后使用ChIP-seq或CUT&Tag来精确定位该转录因子在染色体上的结合位点，最后通过RIP-seq或CLIP-seq来揭示该转录因子与RNA的相互作用。这样的研究顺序有助于逐步深入地理解转录因子的调控机制。

ATAC-seq是一种用于研究染色质可及性的高通量测序技术。主要研究染色质结构对基因转录调控的影响，特别是在转录起始前的染色质准备阶段。它关注的是哪些染色质区域是开放的，即哪些区域对转录因子和其他调控蛋白是可及的。

DNA进行转录前需要解开双螺旋结构，再进行转录，ATAC-seq研究的是转录组的前一步，哪些区域的双螺旋结构打开即将进行转录，特别是那些与转录活性相关的区域，它们的染色质结构会变得更加松散，双螺旋结构更容易被打开。因此ATAC-seq通常与转录组学进行搭配联合分析。

技术原理：

ATAC-seq利用转座酶Tn5（一种来自大肠杆菌的转座酶），识别并结合到开放的染色质区域，并在这些区域切割DNA，同时在切割的DNA两端加上测序接头，并进行高通量测序，从而识别出基因组中的开放染色质区域。

技术特点

1. 高效性：ATAC-seq技术能够在短时间内完成实验，相较于其他技术（如ChIP-seq、DNase-seq等）具有更高的效率。

2. 低起始量：该技术所需的细胞量较低，适用于各种样本类型，包括细胞系、组织以及单细胞等。

3. 高信噪比和特异性：能够精确地识别出开放染色质区域，具有较高的信噪比和特异性。

4. 广泛应用：广泛应用于转录调控机制研究、转录因子结合分析、核小体定位、活性调控元件分布等方面。

ATAC-seq生信分析流程

ATAC-seq通常作为研究染色质开放性的初步步骤，能够在全基因组范围内检测染色质的开放状态，为后续研究提供潜在的调控区域和转录因子结合位点。

ChIP-seq和ATAC-seq的区别：

ATAC-Seq是全基因组范围内检测染色质的开放程度，可以得到全基因组范围内的蛋白质可能结合的位点信息，一般用于不知道特定的转录因子，用此方法与其他方法结合筛查感兴趣的特定调控因子。

ChIP-Seq是明确知道感兴趣的转录因子是什么，根据感兴趣的转录因子设计抗体去做ChIP实验拉DNA，验证感兴趣的转录因子是否与DNA存在相互作用。

ATAC-seq常用组学搭配：

1. ATAC-seq+RNA-seq：解析基因表达的上游调控机制，发现新的基因调控相互作用

2. ATAC-seq+ChlP-seq：精确定位哪些转录因子在哪些开放的染色质区域上结合，发现新的调控元件

ATAC-seq技术应用领域：

1. 临床疾病研究：用于癌症、生殖系统疾病、糖尿病等疾病的发病机制研究和临床生物标志物发现。

2. 药物相关研究：在药物靶点探索及药物开发、药物作用功能及机制研究、耐药及药物敏感性研究等方面发挥重要作用。

3. 植物表观遗传研究：探索特定生物学过程的功能基因，解析基因表达调控的新机制。

4. 生命规律研究：个体或胚胎发育不同阶段表观机制、干细胞分化机制等。

CHIP-seq结合了染色质免疫沉淀和高通量测序技术。首先通过甲醛交联将目标蛋白与染色质连结起来，然后分离基因组DNA并用超声波将其打断成一定长度的小片段。接着添加与目标蛋白质特异的抗体，形成免疫沉淀免疫结合复合体。最后去交联、纯化DNA，并进行测序。该技术用于揭示特定转录因子或蛋白复合物的结合区域。

在ATAC-seq研究之后，通过ChIP-Seq/CUT&Tag深入研究特定转录因子或蛋白在染色质上的结合位点，以及这些结合位点对基因表达的影响。

目前，Chip-Seq的研究主要聚焦于两大领域：一是转录因子的调控机制，二是组蛋白的修饰作用。转录因子通过与DNA的特定序列结合，调控基因的转录活性，从而影响细胞的生长、分化和功能。组蛋白的修饰作用是近年来生物学研究的热点之一。组蛋白是构成染色质的基本结构蛋白，它们的修饰（如甲基化、乙酰化等）能够改变染色质的紧致程度，从而影响基因的可接近性和表达水平。

组蛋白甲基化是表观遗传修饰的一种重要形式，发生在组蛋白N端的赖氨酸（K）或精氨酸（R）残基上。这种修饰对基因表达调控、细胞分化、发育和疾病发生等过程具有重要影响。以下是常见的赖氨酸甲基化位点：

生信分析流程：

1.序列比对：将测序得到的短序列片段匹配到参考基因组序列上。

2.富集区域扫描：从匹配到基因组上的短序列中进行富集区域的扫描，这些富集区通常被认为是蛋白质与DNA相互结合的区域。

3.生信分析：包括基因注释、GO注释、利用基因浏览器进行可视化浏览等，以研究与基因结构的关系等。

CUT&Tag 是一种新型的DNA-蛋白质互作研究技术，主要用于研究转录因子或组蛋白修饰在全基因组上的结合或分布位点。

一、技术原理

CUT&Tag技术的核心在于将Tn5转座酶进行改造，融合protein A/G（形成pA/G-Tn5融合蛋白）。该技术通过针对靶蛋白（如转录因子、染色质重塑蛋白）的抗体和Protein A的介导，使得与Protein A融合的Tn5酶在切割DNA片段的同时在序列两端加上测序接头。随后，经过PCR扩增形成可以直接用于高通量测序的文库。

二、技术特点

CUT&Tag技术在实验流程的简化、样本需求量的降低、信噪比与数据质量的提升以及广泛的应用前景等方面均表现出相较于ChIP-seq的优势。

表现为：clean data 占比高，mapping 率更稳定，peak 位点准确有效，更适用于微量样本，对常见的组蛋白和转录因子具有很好的适用性，且对不同的细胞样本（包括人、动物、植物、微生物等）具有广谱的适用性。

研究研究发现 RNA 结合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）是调节基因表达的关键因素。RBP 功能缺失会导致很多疾病，例如神经病变，自身免疫缺陷和癌症等。为研究 RBPs 调控RNA 的机制，涌现出大量的新技术如 RNA 免疫共沉淀 （RIP），紫外交联免疫沉淀（CLIP）等

RIP-seq是一种将RNA免疫共沉淀（RIP）与高通量测序技术（NGS）相结合的研究方法，主要用于解析细胞内RNA与蛋白质（特别是RNA结合蛋白，RBP）之间的相互作用。

目前，RIP-Seq的研究主要聚焦于RNA与蛋白质的结合以及RNA修饰（如m6A、m7G、m5C等）

一、RNA与蛋白质结合的研究

1. 全转录组范围内RNA-蛋白互作分析：

RIP-Seq技术能够在全转录组范围内系统地揭示RNA分子与RNA结合蛋白（RBP）的相互作用，包括非编码RNA（如lncRNA、miRNA等）与蛋白质的互作。

2. 特定RBP的结合谱研究：

通过针对特定RBP的RIP-Seq实验，可以系统地鉴定该RBP在细胞或组织中的结合RNA谱，从而揭示其在转录后调控中的具体作用机制。

二、RNA修饰研究（如m6A、m7G等）

RNA修饰是指在RNA链的碱基上添加化学修饰基团的过程，这些修饰在细胞中广泛存在，并且在RNA的稳定性、转录后调控、转运和翻译过程中发挥重要的功能。目前已知的RNA修饰类型超过160种，但能够有方法检测到的并不多。

RIP-Seq技术结合特定的抗体（如针对m6A修饰的抗体），可以富集并鉴定出带有特定修饰的RNA分子，从而揭示这些修饰在RNA功能调控中的作用。

甲基化修饰是RNA修饰最常见的类型：

N6-甲基腺苷（m6A）：最常见的RNA甲基化修饰形式之一，在真核生物中广泛存在。m6A修饰通过一系列甲基转移酶的催化作用实现，主要参与到RNA的稳定性、RNA结构紧密性和翻译调控等重要过程。

5-甲基胞嘧啶（m5C）：另一种常见的RNA甲基化修饰形式，在真核生物的tRNA和rRNA中含量最丰富。m5C修饰也通过甲基转移酶的催化作用实现，主要参与到RNA的稳定性和转录后的修饰调控中。

N1-甲基腺苷（m1A）：另一种甲基化修饰形式，虽然不如m6A和m5C常见，但在RNA中也存在并发挥一定的功能。

N7-甲基鸟苷（m7G）：常见于mRNA的5'端帽子结构，对mRNA的稳定性有重要影响。

紫外交联免疫沉淀，是基于RNA分子与RNA结合蛋白在紫外照射下发生共价结合，提高RNA结合蛋白与相应RNA靶标的结合强度，用于研究RNA结合蛋白在体内与众多RNA靶标的结合模式。紫外交联免疫沉淀结合高通量测序，是一项在全基因组水平揭示RNA分子与RNA结合蛋白（RBP）相互作用的革命性技术。

技术优势：

准确性高：从活细胞交联开始，反应了体内环境下真实的分子间互作。每个样本可获得数百万条的序列标签，可发现研究转录组上稀有的蛋白结合位点.

特异性强：紫外辐射不会造成蛋白和蛋白之间的交联，能够鉴定靶蛋白和RNA 之间的直接相互作用。

应用范围广：特别适用于研究剪接因子RNA结合图谱、miRNA作用靶点等研究。

假阳性低：相比于传统预测miRNA靶标方法，能够准确分析小RNA及靶基因高精确率：可获得高水平的信噪比数据，准确区分真实事件与噪音，精确定位蛋白结合位点

RIP-seq与CLIP-seq的区别：

技术原理：CLIP-seq需要紫外交联步骤，而RIP-seq则不需要，这是两者在技术上的主要区别。

应用范围：虽然两者都用于研究RNA与蛋白质的相互作用，但CLIP-seq更侧重于鉴定靶蛋白和RNA之间的特异性结合位点，而RIP-seq则更广泛地用于分析全转录组范围内RNA与蛋白的互作情况。

优势与局限：CLIP-seq的优势在于特异性高，但实验过程相对复杂；RIP-seq则操作简便，但可能存在一定的非特异性结合。